REKLAMA


 

REKLAMA


 

Struktura polimerazy RB69 – kompleks potrójny polimerazy oraz DNA matrycy-startera z wchodzącym nukleotydem. Kolorem niebieskim zaznaczono domenę palców, fioletowym domenę spodu dłoni, zielonym domenę kciuka, czerwonym domenę egzonukleazy, szarym N-końcową domenę. W strukturze tej widać także DNA matrycy (kolor czerwony) i startera (żółty) związane w centrum aktywnym polimerazy. W tym ujęciu nie jest widoczny wchodzący nukleotyd Struktura polimerazy RB69 – kompleks potrójny polimerazy oraz DNA matrycy-startera z wchodzącym nukleotydem. Kolorem niebieskim zaznaczono domenę palców, fioletowym domenę spodu dłoni, zielonym domenę kciuka, czerwonym domenę egzonukleazy, szarym N-końcową domenę. W strukturze tej widać także DNA matrycy (kolor czerwony) i startera (żółty) związane w centrum aktywnym polimerazy. W tym ujęciu nie jest widoczny wchodzący nukleotyd WIkimedia Commons

Powielanie kwasu nukleinowego (RNA lub DNA) ma kluczowe znaczenie dla komórki. Z procesem tym, który musi być niezwykle precyzyjny, doskonale radzą sobie polimerazy. Dzięki specyficznej budowie potrafią zbudować nową nić na podstawie jednoniciowej matrycy


Bebenek_Anna

Autorką tekstu jest Anna Bębenek
Instytut Biochemii i Biofizyki, Polska Akademia Nauk, Warszawa
e-mail: Ten adres pocztowy jest chroniony przed spamowaniem. Aby go zobaczyć, konieczne jest włączenie w przeglądarce obsługi JavaScript.  

 

Dr hab. Anna Bębenek pracuje w Zakładzie Biologii Molekularnej IBB PAN. Kieruje pracownią, która zajmuje się mechanizmami wierności replikacji DNA. Interesuje się zagadnieniami związanymi z oddziaływaniami białek replisomu, a także z przekazywaniem końca startera pomiędzy domenami polimerazy i egzonukleazy. 

 


Pierwsze doniesienia o istnieniu enzymów posiadających zdolność syntetyzowania DNA pojawiły się w 1958 roku, kiedy grupa Arthura Kornberga opisała polimerazę wyizolowaną z bakterii Escherichia coli. Nazwano ją polimerazą I (Pol I). Wkrótce okazało się, że zarówno u bakterii, jak i organizmów eukariotycznych istnieje wiele polimeraz, z których każda odznacza się innymi właściwościami. Intensywny rozwój technik sekwencjonowania przyniósł pod koniec XX wieku nową wiedzę: obecnie znanych jest pięć polimeraz występujących u bakterii, sześć w komórkach drożdży i szesnaście w komórkach ssaków. Na podstawie podobieństwa na poziomie sekwencji aminokwasowej podzielono je na siedem rodzin.

 

Rodzina A obejmuje wszystkie polimerazy przypominające Pol I. Należy do niej m.in. polimeraza Taq wykorzystywana rutynowo w laboratoriach molekularnych do powielania w probówce badanych genów. Rodzina B zawiera główne polimerazy powielające genom w komórkach eukariotycznych, takich jak ludzkie, a także polimerazy bakteriofagów, czyli wirusów żerujących na bakteriach. Rodzina C to głównie polimeraza replikacyjna bakterii E. coli. Pozostałe rodziny (C, X, Y, RT) zawierają polimerazy o specyficznych funkcjach, na przykład występujące u niektórych wirusów polimerazy zdolne do syntezy nici DNA na matrycy RNA czy też telomerazy dobudowujące nić DNA na końcu 3’.

 

Taq – polimeraza najpospoliciej wykorzystywana w laboratoriach molekularnych. Służy do powielania cząsteczek DNA in vitro. Fot. Wikimedia Commons

 

Z różnorodnością polimeraz wiąże się szerokie spektrum ich funkcji, na przykład polimerazy z rodziny X i Y, a także niektóre z rodziny A uczestniczą w procesach naprawy DNA. Ich rola polega na wypełnianiu luk powstałych w czasie działania enzymów naprawczych lub też na syntezie uszkodzonego fragmentu DNA. Jednak najważniejszą funkcją polimeraz jest powielanie materiału genetycznego, który następnie przekazywany jest do komórek potomnych. W procesie tym uczestniczą polimerazy z rodziny A i B. Obok domeny polimerazy, czyli podstawowej jednostki strukturalnej, zawierają one dodatkową domenę korektorską, która usuwa nieprawidłowo wstawione nukleotydy z 3’ końca nowo syntetyzowanego łańcucha.

 

Prawie bezbłędnie

 

Do rozpoczęcia procesu replikacji konieczne jest lokalne rozplecenie helisy DNA w tzw. miejscu inicjacji replikacji. Nić DNA odczytywana jest zawsze w jednym kierunku, od końca 3’ do końca 5’. Kiedy struktura helisy ulegnie rozpleceniu, enzym prymaza syntetyzuje krótkie cząsteczki RNA stanowiące starter dla polimerazy. Polimeraza przypomina trochę pod tym względem niewprawną osobę robiącą na drutach – potrafi kontynuować pracę, tylko jeśli ktoś inny ją zacznie. Wtedy polimeraza rozpoznaje koniec nici RNA zaczętej przez prymazę i od tego miejsca zaczyna dobudowywać kolejne nukleotydy, czyli cegiełki stanowiące podjednostki DNA komplementarne do nukleotydów tworzących sekwencję na matrycy, czyli nici DNA stanowiącej wzorzec. Synteza DNA odbywa się zawsze w kierunku 5’-3’. Cząsteczkami, z których budowane jest nowe DNA, czyli substratem dla polimerazy, są trifosforany dezoksyrybonukleotydów (dNTP), które wbudowywane są do rosnącego łańcucha. Pod względem chemicznym reakcja ta polega na stworzeniu wiązania fosfodiestrowego pomiędzy α fosforanem wchodzącego nukleotydu a grupą 3’-OH ostatniego nukleotydu startera. Towarzyszy temu hydroliza wiązania fosforanowego i uwolnienie dwóch grup fosforanowych tzw. pirofosforanu.

 

Polimeraza nie działa bezbłędnie. Na etapie przyłączania nukleotydu myli się raz na 105-106 replikowanych zasad. Aktywność korektorska pozwala zmniejszyć błąd 100-1000 razy w zależności od rodzaju polimerazy, tak więc ostatecznie podczas replikacji raz na 108-109 zasad do nowo powstającej nici DNA zostaje wstawiony nieprawidłowy nukleotyd.

 

Palce polimerazy

 

Poznanie budowy polimeraz stało się możliwe dzięki pracom Toma Steitza, który w 1985 roku uzyskał pierwszą strukturę krystalograficzną fragmentu Klenowa polimerazy I z E. coli. Od tego czasu poznano struktury prawie wszystkich przedstawicieli poszczególnych rodzin polimeraz. Okazało się, że – niezależnie od różnic w sekwencji aminokwasowej – wszystkie polimerazy mają podobną budowę. Przypominają kształtem półotwartą prawą dłoń, a domenom przypisano nazwy „palce”, „spód dłoni” i „kciuk”.

 

We wszystkich opisanych dotychczas polimerazach centrum aktywne znajduje się na spodzie „dłoni”. Odpowiada ono za wiązanie końca startera i α fosforanu przyłączanego nukleotydu. Miejsce to jest silnie konserwowane, tzn. że w toku ewolucji jego budowa zmienia się bardzo powoli. Mimo pewnych różnic na poziomie sekwencji aminokwasowej struktury domen „spodu dłoni” różnych polimeraz są podobne, co oznacza, że wszystkie polimerazy wykorzystują ten sam mechanizm przekazywania nukleotydu.

 

Reakcja polimeryzacji – włączania komplementarnego do matrycy trifosforanu dezoksyrybonukleotydu (dNTP) do końca startera. Polimeraza przedstawiona jest jako półotwarta prawa dłoń z domenami „palców”, „kciuka” i „spodu dłoni”. Włączaniu nowego nukleotydu towarzyszy zmiana konformacji z otwartej do zamkniętej w czasie wiązania nukleotydu w centrum aktywnym oraz ponownym otworzeniu się polimerazy po zakończeniu inkorporacji nukleotydu

 

Chociaż struktury domen „palców” i „kciuka” różnią się we wszystkich pięciu rodzinach polimeraz, zarówno „palce”, jak i „kciuk” pełnią w nich podobne funkcje. Domena palców uczestniczy w oddziaływaniach polimerazy z jednoniciowym DNA matrycy oraz z dołączanym nukleotydem, czyli cegiełką nowo powstającej nici DNA. W obrębie każdej rodziny polimeraz sekwencja domeny palców jest konserwowana. Z kolei domena kciuka oddziałuje z dwuniciowym DNA i przypuszczalnie odgrywa ona istotną rolę we właściwym ustawieniu matrycowego DNA w centrum aktywnym polimerazy. Ponadto wpływa też na procesywność polimerazy i bierze udział w jej przesuwaniu się na matrycy DNA.

 

Tylko się nie pomyl!

 

Dla zrozumienia działania polimerazy kluczowe znaczenie miały badania kinetyczne oraz porównanie struktur krystalicznych kompleksów złożonych z polimerazy, DNA i dNTP z odpowiadającymi im kompleksami polimerazy związanej tylko z DNA. Dzięki temu odkryto, jak polimeraza odróżnia właściwy nukleotyd od niewłaściwego. Okazało się, że związanie dNTP powoduje istotne zmiany w orientacji przestrzennej DNA i domeny palców, dzięki czemu tworzy się miejsce dla nowo przyłączanego nukleotydu i nukleotydu matrycy. „Dłoń” polimerazy zamyka się – domena palców skręca się w kierunku domeny spodu dłoni, tworząc tzw. zamkniętą konformację. Dzięki temu domeny palców mogą teraz kontaktować się z dołączanym dNTP. Zamykają się one wokół niego i komplementarnej zasady matrycy, tworząc „kieszonkę wiążącą nukleotyd”. To geometria tej kieszonki sprawia, że dołączony może zostać tylko właściwy nukleotyd, czyli odpowiadający nukleotydowi na matrycy. Jeżeli do startera zostanie przyłączony niewłaściwy nukleotyd, to albo palce polimerazy otworzą się i będzie ona szukała nowego prawidłowego nukleotydu, albo – w przypadku polimeraz posiadających funkcję korektorską – koniec startera trafi do centrum aktywnego egzonukleazy, gdzie niewłaściwy nukleotyd zostanie usunięty.

 

Ciekawym wyjątkiem są polimerazy rodziny Y. Charakteryzują się one niską wiernością replikacji na nieuszkodzonym DNA, ale za to potrafią powielać DNA o zaburzonej symetrii, które nie może być powielane przez polimerazy replikacyjne. Centrum aktywne tych polimeraz różni się od pozostałych, a ich kieszonka wiążąca nukleotyd jest znacznie większa i może rozpoznać DNA o zmienionej, zaburzonej strukturze, związać się z nim, a także wstawiać niewłaściwe zasady. Dzięki temu polimerazy z rodziny Y mogą replikować uszkodzone DNA. Kosztem zmniejszonej wierności powielania DNA zachowana jest ciągłość replikacji DNA w komórkach.

 

Co widzimy

 

Nasz wiedza o mechanizmach działania oraz biologicznej roli polimeraz bardzo się poszerzyła z chwilą otrzymania struktur krystalograficznych dla tych enzymów. W naszej pracowni prowadzimy badania nad polimerazą RB69, która stanowi model dla polimeraz rodziny B. Za pomocą ukierunkowanej mutagenezy zmieniamy te aminokwasy, które wydają się istotne dla oddziaływań polimerazy z DNA lub wchodzącego dNTP i charakteryzujemy tak otrzymane mutanty pod kątem ich właściwości. Badamy także wierność prowadzonej przez nie replikacji w testach genetycznych, zarówno in vivo, jak i in vitro. Wyniki z naszej pracowni oraz innych laboratoriów pozwoliły na określenie roli aminokwasów domeny palców tworzących część kieszonki wiążącej nukleotyd oraz roli aminokwasów oddziałujących z fosforanem dołączanego przez polimerazę nukleotydu. Określiliśmy także, jakie rejony polimerazy są odpowiedzialne za oddziaływanie z DNA i wiązanie polimerazy do substratu. Badania takie prowadzone są także na polimerazach należących do innych rodzin, a wyniki uzyskane z tych eksperymentów poprawiły znacznie nasze rozumienie funkcji tych polimeraz w komórce.

 

Kryształy  polimerazy RB69. Wybrane kryształy poddawane są dalszej analizie przy udziale promieniowania rentgenowskiego. Na podstawie rejestracji obrazów dyfrakcyjnych promieniowania X można ustalić rzeczywistą strukturę polimerazy

 

 

Chcesz wiedzieć więcej?

Joyce C.M., Steitz T.A. (1994). Function and structure relationships in DNA polymerases. Annu. Rev. Biochem. 63, 777-822.
Kunkel T.A., Bębenek K. (2000). DNA replication fidelity. Annu. Rev. Biochem. 69, 497-529.
Bębenek A. (2008). Mechanizmy replikacji DNA. Postępy Biochemii 54, 43-56.
Yang W. (2014). An overview of Y-family DNA polymerases and a case study of human DNA polymerase η(eta). Biochemistry 53, 2793-2803.
Doublié S., Zahn K.E. (2014). Structural insight into eukaryotic DNA replication. Front. Microbiol 5, 444.
Xia S., Konigsberg W.H. (2014). RB69 DNA polymerase, structures, kinetics, and fidelity. Biochemistry 53, 2752-2767.


© Academia nr 1 (41) 2015

 

 

Oceń artykuł
(0 głosujących)

Tematy

agrofizyka antropologia kultury antropologia społeczna archeologia archeometalurgia architektura Arctowski arteterapia astrofizyka astronomia badania interdyscyplinarne behawioryzm biochemia biologia biologia antaktyki biologia płci biotechnologia roślin borelioza botanika chemia chemia bioorganiczna chemia fizyczna chemia spożywcza cywilizacja demografia edukacja ekologia ekologia morza ekonomia energia odnawialna etnolingwistyka etnomuzykologia etyka ewolucja fale grawitacyjne farmakologia filozofia finansowanie nauki fizyka fizyka jądrowa gender genetyka geochemia środowiska geoekologia geofizyka geografia geologia geologia planetarna geoturystyka grafen historia historia idei historia literatury historia nauki historia sztuki humanistyka hydrogeologia hydrologia informatyka informatyka teoretyczna internet inżynieria inżynieria materiałowa język językoznawstwo kardiochirurgia klimatologia kobieta w nauce komentarz komunikacja kosmologia kryptografia kryptologia kulinaria kultoznawstwo kultura lingwistyka literatura literaturoznawstwo matematyka medycyna migracje mikrobiologia mineralogia mniejszości etniczne mniejszości narodowe modelowanie procesów geologicznych muzykologia mykologia na czasie nauka obywatelska neurobiologia neuropsychologia nowe członkinie PAN 2017 ochrona przyrody orientalistyka ornitologia paleobiologia paleontologia palinologia parazytologia PIASt politologia polityka społeczna polska na biegunach prawo protonoterapia psychologia psychologia zwierząt Puszcza Białowieska robotyka rozmowa „Academii” seksualność smog socjologia szczepienia sztuka technologia wieś w obiektywie wulkanologia zastosowania zdrowie zoologia zwierzęta źródła energii żywienie

Komentarze

O serwisie

Serwis naukowy prowadzony przez zespół magazynu Academia PAN.Academia Zapraszamy do przysyłania informacji o badaniach, aktualnie realizowanych projektach naukowych oraz imprezach popularyzujących naukę.

 

Dla użytkowników: Regulamin

Pliki cookies

Informujemy, że używamy ciasteczek (plików cookies) w celu gromadzenia danych statystycznych, emisji reklam oraz prawidłowego funkcjonowania niektórych elementów serwisu. Pliki te mogą być umieszczane na Państwa urządzeniach służących do odczytu stron, a korzystając z naszego serwisu wyrażacie Państwo zgodę na używanie cookies, zgodnie z aktualnymi ustawieniami przeglądarki.

Więcej informacji o celu używania i zmianie ustawień ciasteczek w przeglądarce: TUTAJ

Wydanie elektroniczne

Kontakt

  • pisz:

    Redakcja serwisu online
    Academia. Magazyn Polskiej Akademii Nauk
    PKiN, pl. Defilad 1, pok. 2110
    (XXI piętro)
    00-901 Warszawa

  • dzwoń:

    tel./fax (+48 22) 182 66 61 (62)

  • ślij:

    e-mail: academia@pan.pl